水痘-带状疱疹病毒 （Varicella-zoster virus, VZV） 是一种具有高度传染性的嗜神经人 α 疱疹病毒。病毒初次感染时主要引起水痘，痊愈后潜伏在背根神经节和/或颅神经，在免疫力下降或免疫抑制时病毒被重新激活，导致带状疱疹（Herpes zoster, HZ）。

HZ会产生带状疱疹后神经痛（PHN）等并发症，造成神经病理性疼痛和感觉障碍，超过30%的HZ患者疼痛持续超过1年，并且通常难以治疗[1–3]。HZ死亡率仅为0.28-0.69例/百万人，但有着高发病率和沉重的社会负担。全球50岁以上的人口超过95%的接触过VZV，大多数个体都存在患HZ的风险[4]。通过疫苗接种预防HZ是一个重要的全球健康优先事项。

现今，仅有GSK公司Shingrix重组带状疱疹疫苗在美国获批上市并持续生产，在预防50岁以上成人带状疱疹方面的有效性超过90%[5–8]，具有很高的保护效果。

绿光生物科学进行了一项研究，设计了三种由mRNA编码的VZV糖蛋白E（gE），以Shingrix为对照，检测不同形式的疫苗均可诱导高效的体液和细胞免疫应答，且抗原特异性效应T细胞记忆反应在最后一次疫苗接种后持续16周。研究结果发表于NPJ Vaccines期刊。

doi: 10.1038/s41541-024-00865-5

材料和方法

将水痘-带状疱疹病毒Oka株gE序列进行密码子优化，随后进行体外转录，使用氯化锂沉淀纯化mRNA，并将其包封在脂质纳米颗粒（LNP）中。将mRNA-LNP转染HEK293FT细胞，培养 24 h后分别收获细胞和上清液，分析gE蛋白表达。

两种不同的LNP：BroadPharm公司SM102（LNP比较物）和日本NOF公司开发的专有阳离子脂质体。

两种剂量：5 μg高剂量组和1 μg低剂量组。将mRNA-LNP 候选疫苗或Shingrix肌肉注射6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠，间隔4周免疫接种一次。

对照：皮下注射水痘减毒活疫苗（Varivax）的小鼠作为对照组，第4周和第8周接种生理盐水作为对照组。

研究中评估了三种mRNA-LNP候选疫苗的免疫原性，并将其与Shingrix进行比较。为检测CD4+T细胞反应，在Varivax接种后2周以及mRNA-LNP候选疫苗或Shingrix接种后1周和2周采集外周血，用gE重叠肽库刺激外周血单核细胞，并通过双色ELISpot定量分泌IFN-γ和/或IL-2的gE特异性细胞的数量。通过胞内因子染色（ICS）测量小鼠免疫后脾细胞的效应T细胞应答。

为评估候选疫苗免疫记忆，在第二次免疫后16周后小鼠骨髓和脾脏中的效应记忆CD4+T细胞中研究gE特异性长寿浆细胞的存在。使用LEGENDplex™小鼠抗病毒试剂盒检测血清中细胞因子，评估疫苗免疫后的炎症反应。

研究结果

1. 三种不同gE抗原的设计和表达

研究人员设计了三种版本的gE抗原（图1A）：

（i）全长gE（gE full length, gE-FL），存在于病毒体或天然感染细胞的表面[10]；

（ii）截短的gE（gE truncated, gE-T），通过缺失部分C末端结构域产生，并将反式高尔基体网络（TGN）定位基序之一进行Y569A突变[11]；

（iii）可溶性gE（gE soluble, gE-S），E蛋白的细胞外结构域，与Shingrix抗原序列类似。将设计的gE抗原体外转录获得mRNA后，转染HEK293FT细胞，通过WB鉴定证明了所有三种gE变体均成功表达（图1B）。

正如预期，gE-FL和gE-T在细胞裂解液中检测到，而gE-S在上清液中检测到，但无法在细胞裂解物中检测到（图1B）。

图1.三种不同版本的VZV糖蛋白E（gE）的mRNA构建体的设计和表达

分别设计三种VZV gE（图1A），将其转录获得的mRNA转染后，分别收集细胞裂解物（图1B左）和细胞上清液（图1B右）进行WB鉴定。红色条带指示gE蛋白，绿色条带指示β 肌动蛋白，用作内参。

2. GLB mRNA-LNP候选疫苗免疫原性评估

研究人员对三种mRNA-LNP候选疫苗免疫原性进行评估，并将其与Shingrix进行比较。

NOF LNP配制的5 μg疫苗剂量组血清IgG结合抗体水平与Shingrix疫苗免疫组抗体水平相当（图2B）。与SM102 LNP配制的疫苗相比，NOF LNP配制的疫苗以剂量依赖性方式诱导了更高水平的gE特异性的结合抗体（图3C）。在第12周，即疫苗第二次接种后4周结合抗体应答水平最高(图2B和2C)。

图2. 编码三种不同版本VZV gE抗原的mRNA-LNP候选疫苗免疫原性比较

雌性C57BL/6小鼠（每组5只动物）通过皮下免疫人用剂量Varivax，并在Varivax接种后4周和8周分别向小鼠肌肉注射1 μg或5 μg的mRNA-LNP候选疫苗或盐水(仅注射Varivax组)，免疫方案和样本采集时间如图2A。通过ELISA检测指定时间点从小鼠体内采集的血清中gE特异性IgG结合抗体水平如2B所示。箭头指示mRNA-LNP/Shingrix免疫时间点。数据显示为平均值±SEM。检测Varivax初免后12周时，所有免疫组中小鼠血清中gE特异性IgG结合抗体水平，如图2C所示，并基于吸光度值表示为曲线下面积(AUC)(Y轴)。数据显示为平均值±SEM。

3. GLB mRNA-LNP候选疫苗T细胞免疫应答评估

为了评估三种mRNA-LNP候选疫苗诱导的T细胞应答的强度和动力学，用gE重叠肽库刺激外周血单核细胞，测定分泌IFN-γ和/或IL-2的gE特异性细胞的数量。

研究发现Varivax免疫组T细胞应答极弱（图3A），而mRNA-LNP疫苗或Shingrix组效应T细胞应答在每次疫苗接种后第7天达到峰值。其中，与编码gE-FL或gE-T的mRNA-LNP疫苗相比，编码gE-S的可溶性形式的mRNA-LNP疫苗表现较差，这与所使用的LNP制剂的类型无关（图3A和3B）。重要的是，研究人员还发现NOF LNP配制的疫苗可诱导高水平的多功能效应T细胞。

图3. 编码VZV gE的mRNA-LNP候选疫苗诱导强烈的抗原特异性T细胞应答

使用鼠IFN-γ/IL-2双色酶促ELISpot测定候选疫苗第一次免疫后1周（图3A）或第9周（图3B）后所收集的全血细胞。数据显示为平均值±SEM。图3A和3B中的Y轴代表每百万外周血细胞中的斑点形成细胞（SFCs）。每个SFC对应于响应于gE重叠肽库分泌一种或两种细胞因子的效应T细胞。

为了证实上述发现，研究人员进行了补充研究，通过细胞内细胞因子染色（ICS）测定脾细胞的效应T细胞应答。结果显示，gE特异性效应T细胞反应主要是CD4+T细胞介导的，CD8+T细胞分泌细胞因子低于0.5%的（图4B）。NOF或SM102配制的mRNA-LNP疫苗组小鼠体内诱导了有效的CD4+T细胞应答（图4C）。

图4. mRNA-LNP疫苗诱导CD4+T细胞偏向的细胞免疫应答

将动物分成7组，间隔4周直接对小鼠进行肌内注射NOFLNP或SM102 LNP配制的mRNA或Shingrix （图4A）。对照组小鼠注射生理盐水。将注射生理盐水的小鼠作为阴性对照。在最后一次免疫后一周，收获脾脏并用VZV gE蛋白的重叠肽库刺激，并通过流式细胞术测量产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD8+T细胞（图4B）和CD4+ T细胞（图4C）的百分比。

4. GLB mRNA-LNP候选疫苗诱导的免疫记忆评估

为了评估用编码gE抗原的mRNA-LNP候选疫苗是否可以诱导长效的体液免疫应答，在第二次免疫后第16周收集的小鼠的骨髓和脾脏中的效应记忆CD4+T细胞，研究gE特异性长寿浆细胞，如图2A所示。

测定NOF LNP配制的mRNA 5 μg组小鼠gE特异性长寿浆细胞（LLPC），测定骨髓来源的gE特异性抗体分泌细胞（ASC）的数量，发现其与Shingrix组应答水平相当（图5A）。研究人员观察到，NOF LNP配制的5 μg mRNA诱导的gE特异性效应记忆CD4+T细胞应答与Shingrix免疫组应答水平相当（图5B）。

图5. mRNA-LNP候选疫苗在小鼠中诱导抗原特异性LLPCs和TMEM细胞记忆反应

按照图2A所示免疫程序免疫C57BL/6小鼠(每组5只动物)。在最后一次免疫后16周评估免疫记忆。（A）通过B细胞ELISpot测定骨髓中分泌与VZV gE结合的抗体的长寿浆细胞。纵轴代表每百万骨髓来源细胞的斑点形成细胞(SFC)。（B）单独分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2或两种或所有三种细胞因子中的任一种的效应记忆CD4+CD44+CD62L-T细胞（纵轴）的百分比。数据显示为平均值±SEM。

5. GLB mRNA-LNP疫苗免疫后促炎细胞因子水平

为了评估所选全长gE mRNA-LNP疫苗诱导的全身性炎症反应，检测mRNA-LNP（NOF）配制的疫苗或mRNA-LNP（SM102）配制的疫苗或Shingrix第一次免疫后6 h和24 h血清中促炎细胞因子水平。研究发现，NOF和SM102配制的mRNA-LNP疫苗在接种后诱导的促炎细胞因子如MCP-1（图6A）、CXCL-1（图6B）和CXCL-10（图6C）水平显著低于Shingrix。

讨 论

本文提供的数据表明，编码三种不同版本 gE 抗原的 NOF LNP 配制的 mRNA 候选疫苗诱导的 gE 特异性结合抗体水平相当，且与 Shingrix 诱导的抗体水平相当，三种NOF LNP配制的mRNA疫苗可诱导高水平的多功能效应T细胞。

抗体分泌细胞（ASC）包括短寿命和长寿命的浆细胞[12–14]，这些长寿浆细胞（LLPC）主要存在于骨髓中，源于疫苗接种后的生发中心，对其同源抗原表现出高亲和力[15–17]，这些细胞符合记忆细胞的标准[13,18]。因此，LLPC在防止再次感染和保护机体免受外部威胁方面发挥着至关重要的作用。研究发现，由三种 NOF LNP 配制的 mRNA 候选疫苗诱导的 gE 特异性 LLPCS 反应与Shingrix免疫组的反应相当；且四个月后 CD4+效应记忆T细胞的数量与Shingrix免疫组的反应相当。

T细胞介导的免疫应答，尤其是抗原特异性 CD4+T细胞对于保护宿主免受潜伏性 VZV 的再激活非常重要[19,20]。研究表明，mRNA候选疫苗以抗原特异性方式产生了有效的IFN-γ和/或IL-2 CD4+T细胞反应，其中5 μg NOF LNP 配制的mRNA或Shingrix免疫组之间的效应记忆T细胞反应相当。且CD4+效应记忆T细胞的频率高于CD8+效应记忆T细胞的频率，表明记忆反应主要由CD4+T细胞而不是CD8+T细胞介导。

对于疫苗而言，反应原性体现了疫苗接种引发的炎症反应的物理表现，包括趋化因子和细胞因子。对NOF LNP 配制的 mRNA 疫苗的评估结果表明，与Shingrix相比，NOF LNP诱导的促炎细胞因子水平较低，可能成为这一新疫苗的一个竞争优势点。

结 论

研究人员设计并评估了编码三种不同的 VZV gE 抗原的 mRNA-LNP 候选疫苗的免疫原性。动物试验显示，当通过新型NOF LNPs递送时，三种候选药物在大鼠中具有良好的耐受性，并且在小鼠中诱导了诱导有效的体液，细胞和免疫记忆反应。研究人员综合gE特异性抗体滴度、抗原特异性T细胞反应以及LLPC和记忆T细胞水平，选择全长gE和 NOF LNP 制剂用于下一阶段的临床开发。

目前，带状疱疹的疾病预防受到Shingrix疫苗生产问题的限制，这主要是由于其所使用的AS01B佐剂中的天然来源的皂苷成分QS-21的供应有限[22]。这项研究为mRNA疫苗领域提供了一种新型的LNP制剂，虽然基于mRNA的带状疱疹疫苗开发似乎是解决全球有效带状疱疹疫苗供应问题的替代策略，但Shingrix提供的长效保护，仍然是新型疫苗也难望其项背的一座高峰。

来源：Vaccine前研公众号

参考文献：略